Витошко Элина
г. Москва
ГБОУ Школа 1329, 10 класс
РАЗРАБОТКА ТЕРМОСТАБИЛЬНОГО СОСТАВА ДЛЯ ПЦР НАБОРОВ
5
Научный руководитель: Золотарева Мария Сергеевна, г. Москва, РТУ МИРЭА, старший преподаватель
2
Ех
Элина Витошко
52
Ех
РАЗРАБОТКА ТЕРМОСТАБИЛЬНОГО СОСТАВА ДЛЯ ПЦР НАБОРОВ
Актуальность
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – метод молекулярной биологии, применяемый для проведения научных и клинических диагностических исследований. Наиболее широко этот метод применяется сегодня в медицине в области генной диагностики наследственных и инфекционных заболеваний, в частности для выявления COVID-19. Одной из проблем данного метода является необходимость хранения наборов для ПЦР в условиях холодовой цепи, так как Taq-полимераза при повышении температуры теряет активность.
Цель проекта
Разработать термостабильный состав для ПЦР-наборов.
Задачи
  • На основе литературных данных выбрать оптимальный состав для получения термостабильного состава ПЦР-смеси;
  • На модельном эксперименте с бычьим сывороточным альбумином проверить выбранный состав;
  • Проверить выбранный состав на наборе для ПЦР
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – популярный метод молекулярной биологии, применяемый для проведения научных исследований и клинических диагностических исследований. Но все же наиболее широко этот метод применяется сегодня в медицине в области диагностики наследственных и инфекционных заболеваний, в частности для выявления COVID-19.

Одной из проблем данного метода является необходимость перевозки и хранения наборов для ПЦР в условиях холодовой цепи. Самая часто используемая Taq-полимераза при повышении температуры теряет активность. Так, при комнатной температуре (25°С) она хранится лишь 2 месяца. Целью работы является разработка состава для долгосрочного хранения фермента при комнатной температуре и без потери активности, что поможет упростить и ускорить проведения полимеразной цепной реакции, а также сделает её более доступной для потребителя.

Объектом исследования была реакционная смесь для ПЦР лиофилизированная «РеалБест ДНК Borrelia burgdorferi S.I.» производителя АО «Вектор-Бест». В качестве модельного белка использовали альбумин бычий сывороточный (БСА), производитель BioWest. В качестве состава для стабилизации белковых препаратов вне холодовой цепи был выбран один из составов, предложенный Т.Харольд и др. на основе ПВП, маннита, сахарозы и полисорбата 80.

Для оценки возможности термостабилизации выбранным составом белковых препаратов и ПЦР-смеси все компоненты смешивали, растворяли в воде и раскапывали по эппендорфам. Половину пробирок каждого состава оставили в жидком виде, другую половину – лиофильно высушили. Затем каждый состав заложили на хранение при 3-х температурных режимах: 10°С, 25°С и 37°С. Стабильность оценивали через 2 недели, 1 и 2 месяца хранения. Для оценки стабильности БСА регистрировали спектр поглощения в диапазоне длин волн 200-400 нм и фиксировали величину поглощения при 278 нм и при 350 нм, а также проводили электрофорез образцов в полиакриламидном геле в последней точке. Для оценки стабильности ПЦР-смеси проводили ПЦР с контрольным образцом ДНК Borrelia burgdorferi S.I. с визуализацией результата в агарозном геле.


Выбранный состав на основе ПВП, маннита, сахарозы и полисорбата 80 позволяет стабилизировать белки при хранении в течение 2-х месяцев при 37°С в виде лиофилизатов, и в меньшей степени при хранении в жидком виде, а также позволяет сохранить стабильность ДНК-полимеразы в ПЦР-смеси при хранении в виде лиофилизата в течение 2 месяцев при температуре 37°С. В перспективе это поможет снизить затраты на транспортировку и хранение ПЦР-смесей и, как следствие, стоимость готового набора и услуги по проведению ПЦР с его использованием.
Результаты
Данные по спектрофотометрии образцов с БСА при хранении в разных температурных режимах показывают, что с увеличением срока хранения в образцах накапливаются агрегаты (увеличивается поглощение при 350 нм), при этом лиофилизированные образцы оказались более стабильными при хранении. Электрофорез составов через 2 месяца хранения показал, что все составы имеют характерную полосу БСА с молекулярной массой 66 кДа, кроме тех образцов, что хранились при комнатной температуре, что соотносится с данными спектрофотометрии. Результаты полимеразной цепной реакции составов с ПЦР смесью через 2 месяца хранения показали, что выбранная композиция позволяет сохранить активность ДНК-полимеразы при хранении в виде лиофилизата при 10°С и при 37°С, так как для этих образцов на агарозном геле наблюдаются полосы аналогичные стандартному образцу.
Выводы
  • На основе литературных данных для получения термостабильного состава ПЦР-смеси выбран состав на основе поливинилпирролидона, маннита, сахарозы и полисорбата 80.
  • На модельном эксперименте с БСА выявлено, что выбранный состав позволяет стабилизировать белки при хранении в течение 2-х месяцев при 37°С в виде лиофилизатов, и в меньшей степени при хранении в жидком виде.
  • Выбранный состав также позволил сохранить стабильность ДНК-полимеразы в ПЦР смеси «РеалБест ДНК borrelia burgdorferi S.I.» при хранении в виде лиофилизата в течение 2-х месяцев при температуре 37°С.
Расписание работы автора проекта
15 апреля, пт
Диалог с экспертами
Ответы на вопросы
10:00
10:20

11:35 - 11:45

Алексанян Д.Р.
Алексанян К.Г.
15 апреля, чт
10:40
11:00
11:20
Лысенков А.С.
Дюбанов М.В.
Шаповалова О.В.

Задайте вопрос автору проекта
Обязанность отвечать на заданные вопросы остается полностью на участнике. Организаторы форума не несут ответственности за сроки получения ответа.
Заполняя данную форму Вы соглашаетесь с политикой конфиденциальности сайта.
Пообщайтесь с автором в режиме реального времени
Вы можете посмотреть диалог с экспертом и задать вопросы автору в форме вебинара.
Расписание сессий приведено выше